Search

دوشنبه 30 مهر 1397

منو

کروماتوگرافي مايع

تسوت، گياه شناس روسي به عنوان کاشف پديده کروماتوگرافي شناخته شده است. او در اواخر قرن نوزدهم براي جداسازي رنگدانه‌هاي برگ سبز از يک ستون پرشده با کلسيم کربنات استفاده نمود. پس از او، دانشمندان زيادي در توسعه تئوري و روش کروماتوگرافي نقش داشته‌اند. از جمله مارتين و سينج که به علت توصيف کروماتوگرافي تقسيمي موفق به اخذ جايزه نوبل در سال 1952 شدند. در همان سال مارتين به همراه جيمز روش کروماتوگرافي گاز- مايع را معرفي نمود. تلاش‌ها و کوشش‌هاي اين دانشمندان باعث گرديد تا امروزه اين روش به عنوان يکي از مهمترين روش‌هاي کروماتوگرافي در تمامي شاخه‌هاي شيمي و علوم زيستي مطرح شود.
واژه کروماتوگرافي امروزه به دسته‌اي از روش‌ها اطلاق مي‌شود که در آنها جداسازي اجزاء موجود در يک نمونه مخلوط، بر اساس تمايل نسبي هر جزء به فاز ساکن هنگام عبور فاز متحرک از روي و يا درون فاز ساکن است. گونه‌اي که تمايل بيشتري به فاز متحرک دارد با سرعت بيشتري حرکت ‌مي‌کند و بالعکس گونه‌اي که به فاز ساکن تمايل بيشتري دارد، با سرعت کمتري در طول ستون حرکت مي‌کند.
به علت آن که مواد با درجات گوناگون به فازهاي ساکن تمايل دارند، مي‌توان از اين خاصيت جهت جداسازي آنها از يکديگر استفاده نمود. زمان مورد نياز براي حرکت هر جزء در فاصله مشخص را مي‌توان براي تجزيه‌هاي کيفي به کار برد. همچنين مقدار اندازه‌گيري شده براي هر جزء جدا شده نيز جهت تجزيه کمي سودمند است.
کروماتوگرافي با توجه به طبيعت فازهاي ساکن و متحرک به دسته‌هاي مختلفي تقسيم مي‌شود. برخي از روش‌هاي متداول کروماتوگرافي در جدول 1 ذکر شده است.

جدول 1- روش‌هاي متداول کروماتوگرافي [1].

نوع فاز متحرک فاز ساکن
گاز- مايع گاز مايع جذب شده روي جامد
گاز- جامد گاز جامد
زوج يون مايع مايع
تبادل يون مايع رزين تبادل يون
مايع- مايع مايع مايع جذب شده روي جامد
مايع – جامد مايع جامد
لايه نازک مايع جامد
کاغذ مايع مايع روي کاغذ جامد
دفع بر اساس اندازه مايع ژل
کروماتوگرافي فوق بحران مايع فوق بحراني گونه‌هاي آلي متصل به سطح جامد
 
کروماتوگرافي مايع يکي از انواع کروماتوگرافي است که فاز متحرک در آن مايع است. کروماتوگرافي گازي نيز روش ديگري است که در آن فاز متحرک گاز است. اگر فاز متحرک گاز و فاز ساکن مايع باشد، روش را کروماتوگرافي گاز- مايع مي‌نامند. روش‌هاي کروماتوگرافي گاز- جامد، مايع- مايع و مايع- جامد نيز وجود دارند.
کروماتوگرام ، نموداري از پاسخ آشکارساز بر حسب زمان، حجم فاز متحرک يا فاصله است. اطلاعات مفيدي نظير ميزان پيچيدگي نمونه، تعداد اجزاء موجود در نمونه، مشخصات کيفي اجزاي نمونه، درک کمي از درصد گونه‌ها موجود در نمونه و مشخصه‌هاي کارايي ستون، به سادگي از کروماتوگرام قابل حصول هستند.
در HPLC اغلب از ستون‌هاي پر شده با ذرات ريز فاز ساکن استفاده مي‌شود. به همين علت سطح بيشتري از فاز ساکن در ستون در معرض اجزاء نمونه قرار مي‌گيرد و در نتيجه راندمان جداسازي در اين روش بيشتر از ساير روش‌هاي کروماتوگرافي است.
در سيستم HPLC با استفاده از يک سوزن مخصوص وارد پيش ستون مربوطه مي‌شود. هم‌ زمان از يک حلال مخصوص جهت ترکيب شدن با نمونه استفاده مي‌شود. سپس نمونه با حلال مورد نظر ترکيب شده و وارد ستون مربوطه می شود و بر اساس ميزان قطبيت حلال و ترکيب از يکديگر جدا مي‌شوند. همچنین نمونه بر اساس زمان بازداري از يکديگر تفکيک مي‌شوند. شکل زير اجزاي يک سيستم HPLC را نشان مي‌دهد [1].

شکل 1- اجزا سيستم HPLC

 کاربردها:
1- جداسازی، خالص سازی و شناسائی پروتئین ها و ترکیبات آلی بویژه ترکیبات داروئی. همچنین در برخی از آزمایش های مربوط به تعیین غلظت داروها مورد استفاده قرار می گیرد .
2-در تحقیقات پروتومیک (تحقیقاتی که برروی پروتئین ها انجام می شود)، آنالیز و هضم پروتئین

۳-تعیین ساختار پلیمرها
4-مقایسه ساختارهای پروتئین های مختلف

***********************************************************

پیش از دهه 1970 روشهای بسیار کم و غیر قابل اعتمادی جهت کروماتوگرافی در آزمایشگاههای دانشمندان وجود داشت.

      در طول دهه 1970 بیشتر جداسازی مواد شیمیایی توسط روشهای متعددی انجام می شده که شامل کروماتوگرافی ستونی ، کروماتوگرافی کاغذی و کروماتوگرافی لایه نازک بوده است. بهر حال این تکنیکهای کروماتوگرافی جهت شناسایی و تعین غلظت بین مواد مشابه و یکسان کافی نبود.

      در این حین استفاده از روش کروماتوگرافی مایع تحت فشار برای کاهش زمان جداسازی رواج پیدا کرد و کاهش زمان خالص سازی ترکیبات بروش کروماتوگرافی ستونی انجام شد.

  به هر حال شدت جریان مایع درون این ستون ثابت و پایدار نبود و مدتها این سوال مطرح بوده که بهتر نیست این شدت جریان یا فشار ثابت باشد ؟ ( از کتاب شیمی تجزیه ، جلد 62 ، شماره 19 ، یکم اکتبر 1990 ).

      توسعه کروماتوگرافی مایع با فشار بالا در اواسط دهه 1970 انجام شد و پیشرفت و تکامل آن مقارن شد با تکامل مواد پک شده درون ستون کروماتوگرافی و همچنین ردیابهای اتوماتیکی که می توانستند بصورت آنلاین مقدار عبور مایع را محاسبه نمایند.

      در اواخر دهه 1970 ، روشهای جدیدی شامل کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس این امکان را فراهم کرد تا جداسازی ترکیبات بسیار مشابه ، عملی گردد. در دهه 1980 ، بطور رایجتری از HPLC  برای جداسازی ترکیبات شیمیایی استفاده می شده است.

     تکنیکهای جدید روشهای جداسازی ، شناسایی ، خالص سازی و محاسبه مقدار را متفاوت از گذشته توسعه داد. همچنین برای تسهیل در کار HPLC  ، کامپیوتر و اتوماسیون به سایر روشها اضافه گردید.

      به مرور تکامل انواع ستونها ، تولید ستونهای بسیار باریک ، ستونهای پیوسته باعث سرعت در کار HPLC  گردید. در دهه گذشته شاهد ظهور میکرو ستونها و ستونهای تخصصی شده برای  HPLC  بوده ایم. قطر معمول میکروستونها یا ستونهای مویی شکل ، حدود µm  3  تا   µm  200 دارد.

      طول ستونهای HPLC سریع ،  کمتر از ستونهای HPLC  معمولی و برابر mm  3  است و در بخشهای بسیار کوچک در دستگاه HPLC  جاسازی می گردند.
 

هر چند که امروزه HPLC مورد توجه تحقیقات بیوتکنولوژیکی ، شیمیایی و بیوشیمیایی و همچنین صنایع داروسازی است اما این موارد فقط   50 درصد  استفاده کنندگان HPLC  را نشان میدهد. ( از کتاب شیمی تجزیه ، جلد 62 ، شماره 19 ، یکم

 

 اکتبر 1990 ).

 در حال حاضر از HPLC در صنایع آرایشی ، غذایی ، تولید انرژی و صنایع زیست محیطی استفاده می شود.

برگرفته از وبلاگ بیوتکنولوژی

************************************************

مهمترين قسمتهاي يك دستگاه HPLC عبارتست از:

1 -  سيستم انتقال حلال (پمپ)

2 – محل تزريق (Injector)

3 – ستون

4 – آشكار ساز

5 – كامپيوتر براي ارزيابي ديتا ها

حلالها در HPLC :

مهمترين حلالهايي كه در HPLC استفاده ميشوند عبارتند از : متانل – استونيتريل – آب مقطر – بافرها

آب مقطر مورد استفاده بايد آب مقطر 2 بار تقطير باشد و قبل از استفاده حتما با فيلتر هاي آبي 45/0 ميكرون فيلتر شود.

بقيه حلالها بايد كيفيت مناسب از نظر خلوص را داشته باشند يا به عبارت ديگر گريد HPLC‌باشند. بهتر است كه جهت اطمينان اين حلالها هم قبل از استفاده با فيلترهاي آلي 45/0 ميكرون فيلتر شوند.

 يك نكته مهم اينست كه در HPLC حلالهاي ما بايد عاري از گاز هايي مثل اكسيژن باشند كه براي اين كار از گاز هليوم با خلوص بسيار بالا استفاده ميشود.

ستون:

انتخاب نوع ستون بستگي به ماده مورد آزمون دارد و در واقع بر اساس آن انتخاب ميشود.ستونها با مواد مختلفي پر ميشوند. مثلا ستون C18 از سيليكاژل اصلاح شده پر شده است.

آشكارساز(Detector):

اكثرا از آشكارسازهاي UV استفاده ميشود.

ارزيابي ديتاها:

براي ارزيابي ديتاها نياز به يك دستگاه كامپيوتر داريم كه بايد برنامه نرم افزاري مربوط به آن دستگاه HPLC روي كامپيوتر نصب شده باشد.براي ارزيابي ديتاها اغلب از سطح زير پيكها استفاده ميشود نه ارتفاع پيك.

شروع كار با دستگاه:

در ابتدا بايد مسير شسته شود و فرض كنيم كه نميدانيم نفر قبلي از چه حلالهايي استفاده كرده است ابتدا مطمئن شويد كه ستون از دستگاه جدا شده باشد سپس با اسيد نيتريك 30% به مدت 10 دقيقه شستشو دهيد سپس 1 ساعت با آب مقطر.

حال ميتوانيد ستون مورد نظرتان را وصل كرده با مخلوط 50:50 متانل و آب شستشو دهيد تا جذبي كه دستگاه نشان ميدهد ثابت بماند.سپس با فاز متحركي كه مي خواهيد با آن كار كنيد را تزريق كنيد تا مسيرها و ستون را شستشو دهد تا زمانيكه عدد مربوط به جذب ثابت بماند.

وقتي اين عدد ثابت ماند به دستگاه اعلام ميكنيم كه جذب مربوط به فاز متحرك را صفر در نظر بگيرد.

**

نكات مهم:

ترتيب روشن كردن قسمتهاي مختلف دستگاه: كامپيوتر(اگر تنظيمات پمپ با آن انجام ميشود) – پمپ- تزريق كننده و سپس آشكارساز.

*بعد از روشن كردن پمپ مطمئن شويد كه حلالي كه مسير و ستون را شستشو ميدهد پس از انجام وظيفه خود توسط شلنگ مربوطه از سيستم خارج شده و به درون ظرف دور ريز ميريزد. اگر چنين نبود به احتمال زياد در پمپ هوا وجود دارد كه به كمك يك سرنگ آنرا خالي كنيد.

*هرگز مستقيما فاز متحرك را از بافر به استونيتريل 100% و بالعكس تغيير ندهيد چون باعث رسوب نمك بافر در دستگاه ميشود.

راه اندازي فروشگاه در Eforosh رايگان است