Search

شنبه 31 شهريور 1397

منو

همه چیز HPLC

کروماتوگرافی مایع با فشار بالا

كروماتوگرافی روشي است براي تشخیص و جدا سازی و اندازه گيري مواد

HPLC يعني كروماتوگرافي مايع با فشار زياد يا كروماتوگرافی مايع با كاركرد عالي است.

HPLC از دو فاز ثابت و متحرك تشكيل شده است. كه فاز ثابت جامد و فاز متحرك مايع است.


اجزاء و قسمتهاي مختلف دستگاه HPLC
1- مخازن محلول :

 

كه در آنها فاز متحرك و يا محلول هاي شستشو دهنده ستون ريخته شده است.
2- موتور يا پمپ:

چون ستونها نسبتا طويل و اندازه ذرات كم است. به اين جهت قابليت نفوذ كم مي شود و براي اين كه محلول جريان داشته باشد بايد فشار وجود داشته باشد. براي ايجاد فشار از پمپ ها استفاده مي كنيم. پمپ فشاري حدود psi 4500 مي تواند ايجاد كند و بايد فشار آن ثابت باشد.

محلول توسط پمپ با جریان ثابتي بر روي فاز ثابت حركت داده مي شود. حداكثر جریانی كه فاز متحرك مي تواند داشته باشد ۲،۵ملی لیتر در یک دقیقه است. و نظر به نوع كاري كه مي خواهيم انجام دهيم فلو یا جریان فرق مي كند. هر چه جریان كمتر باشد، فاصله پيك ها بيشتر است.

ميزان فشار بستگي به جریان دارد وقتي جریان ml/min 0.8 است ميزان فشار حدود psi 1500 مي شود. ميزان فشار بستگي به نوع ستون دارد حداكثر فشار مجاز Psi 3500 است. حداكثر تغييرات فشار Psi 100 است. حداكثر فلوريت Flow rate ، ml/min 2.5 است. پس پمپ، محلول را از مخزن مي گيرد و با سرعت معین آن را بداخل دستگاه وارد مي كند.

به دو روش مي توانيم كار كنيم:

الف: روش ايزوكراتيك isocratic

اگر نسبت هاي مختلفی از فاز متحرك را در يك مخزن بريزيم و از همان مخزن فاز متحرك را برداشت كنيم از روش ايزوكراتيك استفاده كرده ايم.
ب: روش گراديانت gradient :

اجزاء فاز متحرك در مخازن مختلف قرار دارند. دستگاه قابليت اين را دارد كه خودش نسبت هاي مختلف را از مخازن برداشت كند، مثلا می خواهيم ازمخزن اول ۸۰ فیصد از مخزن دوم ۸ فیصد و از مخزن سوم ۱۲ فیصدبكشد و بعد نسبت ها را مخلوط مي كند. از اين روش وقتي استفاده مي كنيم كه نسبت هاي موردنظر را نمی دانيم و بخواهيم روش کارپيدا كنيم. ولي وقتي درصد فاز متحرك براي ما روشن شد مي توانيم از روش ايزوكراتيك استفاده كنيم. فاز متحرك با جریان ثابتي بر روي ستون حركت داده مي شود.

حداكثر فلو یا جریان در این تجربه ml/min0.8 يا 1 است. بعد از فعال كردن هر پمپ flow rate را از كم به زياد كم كم بالا مي بريم تا حدود ml/min  0.8 يا 1 و مي گذاريم حدود پانزده دقیقه يا نيم ساعت با فلوريت بالا كار كند و بعد فلوريت را به تدريج پايين مي آوريم تا صفر و بعد پمپ را عوض مي كنيم. يا دستگاه را خاموش مي كنيم، فلوريت كه بالا برود فشار هم بالا مي رود. بعد از اتمام كار ستون را با محلول هاي شستشو دهنده مي شوئيم. محلول هاي شستشو را در مخازن ريخته و پمپ ها را به ترتيب فعال مي كنيم اول دستگاه را با آب و متیانول شسته و سپس با متیانول خالص مي شوئيم. هر پمپ را كه فعال كرديم بايد ابتدا هوا گیری کنیم.
3- انجکتر injector:

از سوزن های مختلف با ظرفيت هاي مختلف استفاده مي كنيم. حجم تزريق ۳- ميكروليتر است. نمونه ابتدا وارد قسمتي بنام گارد كالوم يا پري كالوم مي شود كه محافظ ستون است، طول كاردكالوم حدو يك سانتي متر است. و جنس آن از فولاد ضد زنگ است، و ماده پركننده آن از جنس ماده پركننده ستون است. اگر ماده مورد تشخیص ناخالصي داشته باشد يا با ماده داخل ستون عملیه کیمیاوی ايجاد كند درگاردكالوم انجام مي شود و به ستون آسيبي نمي رسد.
4- ستون:

طول ستونهاي دستگاه حدود 30-10 سانتي متر است. و جنس آن از فولاد ضدزنگ است. پرمصرف ترين ستون C18 ، ODS آکتا دسيل سيلان است، ستونها را پس از اتمام كار بايد با محلولهاي شستشو دهنده شست. اگر از بافرفسفات استفاده كرديم ستون را با آب و متیانول و بعد با متیانول خالص شستشو مي دهيم.

فاز ثابت بصورت ذرات ريزي در داخل ستون قرار گرفته است كه بر اثر چسبيدن و پخش شدن اجزاء نمونه و عبور فاز متحرك جداسازي انجام مي شود. نمونه ابتدا وارد گاردكالوم و بعد وارد ستون مي شود. ODS اكتا دسيل سيلان گروههاي الكيل غيرقطبي زيادي دارد، فاز متحركي كه استفاده مي كنيم اکثرا قطبي است. فاز متحرك و ماده پركننده ستون از نظر قطبيت بايد عكس هم باشند.

در HPLC امکان استفاده از فاز نرمال و معكوس هست. اگر فاز ثابت قطبي و فاز متحرك غيرقطبي باشد سيستم را فاز نرمال و در صورتي كه ستون غيرقطبي و محلول قطبي باشد درین صورت سيستم را فاز معكوس مي گويند. مشتقات آلكيل سيلان و فنيل سيلان ايجاد ستونهاي غير قطبي مي كنند و معمولا ستون غير قطبي و فاز متحرك قطبي است بنابراين از فاز معكوس استفاده می شود. جنس ستونها از فولاد ضدزنگ يا Stainless steel است.
5- دتکتور ها:

دتکتور ها بايد حساس باشند و اثر مخرب بر روي اجسام نداشته باشند. پاسخ آنها تا حدود وسيعي براي غلظت بايد خطي باشد.

انواع دتکتور ها:

(a)- مهمترين آنها دتکتور ماورا بنفش است که براي اجسامي كه در ناحيه UV-VIS جذب داشته باشند مورد استفاده قرار می گیرد. در اين دتكتور جذب انجام مي شود و باعث كاسته شدن انرژي مي شود كه اين كاسته شدن قابل اندازه گيري است. ميزان كاسته شدن انرژي متناسب است با غلظت، بايد طول موج را مشخص كنيم كه در اينجاnm  λ=225 است. محلول نبايد در طول موج انتخابي جذب داشته باشد..
(b)- دتکتور ضريب شكست، اين  دتکتور خيلي حساس به حرارت است. از تغييرات يا تفاوتي كه بين ضريب شكست سيستم محلول به تنهايي و سيستم محلول همراه نمونه ايجاد مي شود استفاده مي كنيم.
(c)- دتكتور فلورسانس حساس تر از UV است ولي كم استفاده مي باشد چون موادي كه خاصيت فلورسانس داشته باشند كم هستند.
(d)- دتکتور الكتروشيميايي كه عملکرد آن بر مبنای عملیه های اکسید و احیا می باشد.

6- ثبت کننده (ریكاردر):

در اثر حركات قلم پيك هائي رسم مي شود كه به مجموعه آنها كروماتوگرام مي گويند. به طريق كيفي پيك ها را براساس زمان اقامت يا نگهداري يا Retention time مي شناسند. زمان اقامتت فاصله زماني از لحظه تزريق تا رسيدن به نقطه اوج يك پيك است. براي محاسبه كمي سطح هر نوار جذبي را حساب مي كنيم، سطح هر نوار جذبي متناسب با مقدار جسم است كه بوسيله انتگراتور يا سطح سنج با دستگاه ثبات بدست مي آيد سطح هر نوار جذبي يعني حاصلضرب قاعده و نصف ارتفاع است. روش بريدن نوار و وزن كردن آنها روش قديمي است ولي امروزه توسط سطح سنج يا انتگراتور بدست مي آيد خود دستگاه AUC را مشخص مي كند. مي توان از ارتفاع هم استفاده كرد و نسبت ارتفاع ها را مشخص كنيم AUC و ارتفاع با يك دستور ساده قابل تبديل بهم هستند.

طریقه عمل ستون HPLC

کار این ستون نیز به اندازه ذرات داخل ستون بستگی دارد. هرچه اندازه ذرات کوچک‌تر باشد، کیفیت HPLC پیشتر می‌شود.

فاز ساکن و فاز متحرک
در مورد فاز‌های ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد و آن ، این است که باید خاصیت قطبی بودن حل‌شونده و فاز متحرک ، نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد. ترتیب قطبیت گروه‌های عاملی در ترکیبات به صورت زیر است:

هایدروکاربن< ایترها < استرها < کیتن‌ها < الدهایدها < آمیدها < آمین‌ها < الکول‌ها

به عنوان مثال ، فاز ساکن با قطبیت بالا مثل سیلیکات یا آلومین یا مایعات قطبی مثل تری‌اتیلن گلیگول که روی ذرات سیلیکات قرار گرفته‌اند و فاز متحرک ، محلول نسبتا غیر قطبی مثل هگزان یا ایزو پروپیل اتر را می‌توان نام برد.

خصوصیات فاز متحرک ( HPLC )
خالص بودن
نقطه جوش حدود 20 تا 50 بالاتر از درجه حرارت ستون
چسپناکی کم
تعامل پذیری کم
قابلیت تطابق با آشکارساز
سمیت و اشتعال پذیری کم

مزایای HPLC
کاربرد HPLC برای مواد غیر فرار به قرار زیر می‌باشد:
از ستون‌های طولانی که سرعت محلول در تمام طول آنها نزدیک به مطلوب‌ترین سرعت باشد، می‌توان استفاده کرد و امکان تغییر دادن ماهیت فاز متحرک برای انجام شستشوی تدریجی و شستشوی مرحله‌ای یا هر دو وجود دارد.

آشکارساز
آشکارسازهای مورد استفاده در کروماتوگرافی مایع - مایع تمام خصوصیات آشکارسازهای کروماتوگرافی گازی را دارند، بجز اینکه در آشکارساز کروماتوگرافی مایع نیازی به محدوده حرارت بالا نیست. این شناساگرها کلا دو دسته‌اند:

یک نوع کلی که به فاز متحرک عکس‌العمل نشان می‌دهند.
نوع خاصی که به حل شونده حساس هستند.

- جداسازی، خالص سازی و شناسائی پروتئین ها و ترکیبات آلی بویژه ترکیبات دوائی. همچنین در برخی از آزمایش های مربوط به تعیین غلظت دواها مورد استفاده قرار می گیرد .
۲- در تحقیقات پروتومیک (تحقیقاتی که برروی پروتئین ها انجام می شود)، آنالیز و هضم پروتئین
۳- تعیین ساختار پلیمرها
۴- مقایسه ساختارهای پروتئین های مختلف

مهمترين قسمتهاي يك دستگاه HPLC عبارتست از:

۱-  سيستم انتقال محلول (پمپ)
۲ – محل تزريق (Injector)

۳- ستون

۴- آشكار ساز

۵-  كامپيوتر براي ارزيابي ديتا ها

محلول ها در HPLC :

مهمترين محلول هايي كه در HPLC استفاده ميشوند عبارتند از : میتانول – استونيتريل – آب مقطر – بافرها

آب مقطر مورد استفاده بايد آب مقطر 2 بار تقطير باشد و قبل از استفاده حتما با فيلتر هاي آبي 45/0 ميكرون فيلتر شود.

بقيه محلول ها بايد كيفيت مناسب از نظر خالصیت را داشته باشند يا به عبارت ديگر گريد HPLC‌باشند. بهتر است كه جهت اطمينان اين محلول ها هم قبل از استفاده با فيلترهاي آلي 45/0 ميكرون فيلتر شوند.

يك نكته مهم اينست كه در HPLC محلول هاي ما بايد عاري از گاز هايي مثل اكسيژن باشند كه براي اين كار از گاز هليوم با خالصیت بسيار بالا استفاده ميشود.

ستون:

انتخاب نوع ستون بستگي به ماده مورد آزمون دارد و در واقع بر اساس آن انتخاب ميشود.ستونها با مواد مختلفي پر ميشوند. مثلا ستون C18 از سيليكاژل اصلاح شده پر شده است.

آشكارساز(Detector):

اكثرا از آشكارسازهاي UV استفاده ميشود.

ارزيابي ديتاها:

براي ارزيابي ديتاها نياز به يك دستگاه كامپيوتر داريم كه بايد پروگرام مربوط به آن دستگاه HPLC روي كامپيوتر نصب شده باشد. براي ارزيابي ديتاها اغلب از سطح زير پيكها استفاده ميشود نه ارتفاع پيك.


نكات مهم:

* ترتيب روشن كردن قسمتهاي مختلف دستگاه: كامپيوتر(اگر تنظيمات پمپ با آن انجام ميشود) – پمپ- تزريق كننده و سپس آشكارساز.
* بعد از روشن كردن پمپ مطمئن شويد كه محلولي كه مسير و ستون را شستشو ميدهد پس از انجام وظيفه خود توسط شلنگ مربوطه از سيستم خارج شده و به درون ظرف دور ريز ميريزد. اگر چنين نبود به احتمال زياد در پمپ هوا وجود دارد كه به كمك يك سرنگ آنرا خالي كنيد.
* هرگز مستقيما فاز متحرك را از بافر به استونيتريل 100% و بالعكس تغيير ندهيد چون باعث رسوب نمك بافر در دستگاه ميشود.

تاریخچه اچ پی ال سی:

 

پیش از دهه 1970 روشهای بسیار کم و غیر قابل اعتمادی جهت کروماتوگرافی در لابراتوارهای دانشمندان وجود داشت.
در طول دهه 1970 بیشتر جداسازی مواد کیمیاوی توسط روشهای متعددی انجام می شده که شامل کروماتوگرافی ستونی ، کروماتوگرافی کاغذی و کروماتوگرافی قشر نازک بوده است. بهر حال این تکنیکهای کروماتوگرافی جهت شناسایی و تعین غلظت بین مواد مشابه و یکسان کافی نبود.
در این حین استفاده از روش کروماتوگرافی مایع تحت فشار برای کاهش زمان جداسازی رواج پیدا کرد و کاهش زمان خالص سازی ترکیبات بروش کروماتوگرافی ستونی انجام شد.

به هر حال شدت جریان مایع درون این ستون ثابت و پایدار نبود و مدتها این سوال مطرح بوده که بهتر نیست این شدت جریان یا فشار ثابت باشد ؟ ( از کتاب شیمی تجزیه ، جلد 62 ، شماره 19 ، یکم اکتبر 1990 ).
توسعه کروماتوگرافی مایع با فشار بالا در اواسط دهه 1970 انجام شد و پیشرفت و تکامل آن مقارن شد با تکامل مواد پک شده درون ستون کروماتوگرافی و همچنین دتکتورهای اتوماتیکی که می توانستند بصورت آنلاین مقدار عبور مایع را محاسبه نمایند.
در اواخر دهه 1970 ، روشهای جدیدی شامل کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس این امکان را فراهم کرد تا جداسازی ترکیبات بسیار مشابه ، عملی گردد. در دهه 1980 ، بطور رایجتری از HPLC  برای جداسازی ترکیبات کیمیاوی استفاده می شده است.
تکنیکهای جدید روشهای جداسازی ، شناسایی ، خالص سازی و محاسبه مقدار را متفاوت از گذشته توسعه داد. همچنین برای تسهیل در کار HPLC  ، کامپیوتر و اتوماسیون به سایر روشها اضافه گردید.

به مرور تکامل انواع ستونها ، تولید ستونهای بسیار باریک ، ستونهای پیوسته باعث سرعت در کار HPLC  گردید. در دهه گذشته شاهد ظهور میکرو ستونها و ستونهای تخصصی شده برای  HPLC  بوده ایم. قطر معمول میکروستونها یا ستونهای مویی شکل ، حدود µm  3  تا   µm  200 دارد.
طول ستونهای HPLC سریع ،  کمتر از ستونهای HPLC  معمولی و برابر mm  3  است و در بخشهای بسیار کوچک در دستگاه HPLC  جاسازی می گردند.


هر چند که امروزه HPLC مورد توجه تحقیقات بیوتکنولوژیکی ، کیمیاوی و بیوکیمیاوی و همچنین صنایع دواسازی است اما این موارد فقط   50 درصد  استفاده کنندگان HPLC  را نشان میدهد. ( از کتاب شیمی تجزیه ، جلد 62 ، شماره 19 ، یکم اکتبر 1990 ).

در حال حاضر از HPLC در صنایع آرایشی ، غذایی ، تولید انرژی و صنایع زیست محیطی استفاده می شود.

تسوت، گياه شناس روسي به عنوان کاشف پديده کروماتوگرافي شناخته شده است. او در اواخر قرن نوزدهم براي جداسازي رنگدانه‌هاي برگ سبز از يک ستون پرشده با کلسيم کربنات استفاده نمود. پس از او، دانشمندان زيادي در توسعه تئوري و روش کروماتوگرافي نقش داشته‌اند. از جمله مارتين و سينج که به علت توصيف کروماتوگرافي تقسيمي موفق به اخذ جايزه نوبل در سال 1952 شدند. در همان سال مارتين به همراه جيمز روش کروماتوگرافي گاز- مايع را معرفي نمود. تلاش‌ها و کوشش‌هاي اين دانشمندان باعث گرديد تا امروزه اين روش به عنوان يکي از مهمترين روش‌هاي کروماتوگرافي در تمامي شاخه‌هاي شيمي و علوم زيستي مطرح شود.
واژه کروماتوگرافي امروزه به دسته‌اي از روش‌ها اطلاق مي‌شود که در آنها جداسازي اجزاء موجود در يک نمونه مخلوط، بر اساس تمايل نسبي هر جزء به فاز ساکن هنگام عبور فاز متحرک از روي و يا درون فاز ساکن است. گونه‌اي که تمايل بيشتري به فاز متحرک دارد با سرعت بيشتري حرکت ‌مي‌کند و بالعکس گونه‌اي که به فاز ساکن تمايل بيشتري دارد، با سرعت کمتري در طول ستون حرکت مي‌کند.
به علت آن که مواد با درجات گوناگون به فازهاي ساکن تمايل دارند، مي‌توان از اين خاصيت جهت جداسازي آنها از يکديگر استفاده نمود. زمان مورد نياز براي حرکت هر جزء در فاصله مشخص را مي‌توان براي تجزيه‌هاي کيفي به کار برد. همچنين مقدار اندازه‌گيري شده براي هر جزء جدا شده نيز جهت تجزيه کمي سودمند است.
کروماتوگرافي با توجه به طبيعت فازهاي ساکن و متحرک به دسته‌هاي مختلفي تقسيم مي‌شود. برخي از روش‌هاي متداول کروماتوگرافي در جدول 1 ذکر شده است.
جدول 1- روش‌هاي متداول کروماتوگرافي [1].

نوع    فاز متحرک    فاز ساکن
گاز- مايع    گاز    مايع جذب شده روي جامد
گاز- جامد    گاز    جامد
زوج يون    مايع    مايع
تبادل يون    مايع    رزين تبادل يون
مايع- مايع    مايع    مايع جذب شده روي جامد
مايع – جامد    مايع    جامد
لايه نازک    مايع    جامد
کاغذ    مايع    مايع روي کاغذ جامد
دفع بر اساس اندازه    مايع    ژل
کروماتوگرافي فوق بحران    مايع فوق بحراني    گونه‌هاي آلي متصل به سطح جامد

کروماتوگرافي مايع يکي از انواع کروماتوگرافي است که فاز متحرک در آن مايع است. کروماتوگرافي گازي نيز روش ديگري است که در آن فاز متحرک گاز است. اگر فاز متحرک گاز و فاز ساکن مايع باشد، روش را کروماتوگرافي گاز- مايع مي‌نامند. روش‌هاي کروماتوگرافي گاز- جامد، مايع- مايع و مايع- جامد نيز وجود دارند.
کروماتوگرام ، نموداري از پاسخ آشکارساز بر حسب زمان، حجم فاز متحرک يا فاصله است. اطلاعات مفيدي نظير ميزان پيچيدگي نمونه، تعداد اجزاء موجود در نمونه، مشخصات کيفي اجزاي نمونه، درک کمي از درصد گونه‌ها موجود در نمونه و مشخصه‌هاي کارايي ستون، به سادگي از کروماتوگرام قابل حصول هستند.
در HPLC اغلب از ستون‌هاي پر شده با ذرات ريز فاز ساکن استفاده مي‌شود. به همين علت سطح بيشتري از فاز ساکن در ستون در معرض اجزاء نمونه قرار مي‌گيرد و در نتيجه راندمان جداسازي در اين روش بيشتر از ساير روش‌هاي کروماتوگرافي است.
در سيستم HPLC با استفاده از يک سوزن مخصوص وارد پيش ستون مربوطه مي‌شود. هم‌ زمان از يک محلول مخصوص جهت ترکيب شدن با نمونه استفاده مي‌شود. سپس نمونه با محلول مورد نظر ترکيب شده و وارد ستون مربوطه می شود و بر اساس ميزان قطبيت محلول و ترکيب از يکديگر جدا مي‌شوند. همچنین نمونه بر اساس زمان بازداري از يکديگر تفکيک مي‌شوند.

راه اندازي فروشگاه در Eforosh رايگان است